ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ ГРУПП ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАЗЛИЧНЫМ ВИДАМ ПЛАСТИКА

RESEARCH OF THE ACTIVITY OF BASIC GROUPS OF SOIL MICROORGANISMS IN RESPECT TO VARIOUS KINDS OF PLASTIC

Для обнаружения и количественного учета микроорганизмов в почвенных образцах был выбран метод посева из разведений почвенных суспензий на плотные питательные среды. Следует отметить, что данный метод является не единственным и не самым совершенным для количественного учета микроорганизмов в почве. Число бактерий, например, учитываемое с помощью прямого метода люминесцентного микроскопирования почвенной суспензии, в 1000 раз превышает количество бактерий, учитываемое методом посева. [1]

Для обеспечения стерильных условий проведения микробиологического анализа была проведена стерилизация необходимой лабораторной посуды (чашки Петри, стеклянные пипетки объемом 1 мл, шпатели, флаконы объемом 200 мл с ватно-марлевыми пробками) в стерилизационных крафт-пакетах в сухожаровом шкафу при 180 °С в течение 60 минут. Вода для приготовления почвенных суспензий и разведений прошла стерилизацию горячим паром в автоклаве в течение 30 минут при температуре 121 °С давление 1 ати. Перед выполнением микробиологического анализа в помещении была проведена влажная уборка с использованием дезинфицирующего раствора NaOCl и обеззараживание бактерицидной лампой в течение 20 минут.

Количественный учет микроорганизмов проводился по 3-ем основным группам: бактерии, актиномицеты, грибы. Для каждой группы были подобраны и приготовлены питательные среды:

  • Среда №1 – сусло-агар – для обнаружения грибов;
  • Среда № 2 – крахмало-аммиачный агар (КАА) для подсчета актиномицетов;
  • Среда №3 – Питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГМФ - агар) на основе гидролизата говяжьего мяса ферментативного.

Каждая питательная среда в соответствии с инструкцией была проавтоклавирована и разлита по чашкам Петри с соблюдением стерильных условий. После этого чашки Петри со средой оставляют на неделю в помещении лаборатории на провокацию.

Подготовка почвенных образцов заключается в удалении крупных корешков растений. После подготовки почвенных образцов на лабораторных весах отмеряют 1 г почвы, насыпая ее на стерильные кружки фильтровальной бумаги. Затем отмеренную навеску почвы переносят во флакон с 90 мл стерильной дистиллированной воды. Таким образом готовятся 6 почвенных суспензий для проведения дальнейшего анализа. Затем с помощью стерильных пипеток в пламени спиртовки методом предельных разведений получают необходимую степень разведения – 105 .

После этого производят посевы на твердую питательную среду. Так, из каждого флакона с разведением почвенной суспензии варианта опыта 105 отбирают стерильной стеклянной пипеткой в пламени спиртовки 0,1 мл и помещают в чашки Петри с необходимой питательной средой. Использованную пипетку опускают с емкость с дезинфицирующим раствором. Затем с помощью стерильного шпателя в пламени спиртовки втирают каплю жидкости в поверхность твердой питательной среды, равномерно распределяя ее по поверхности.

После проведения данной операции использованные шпатели также помещаются в емкость с дезинфицирующим раствором, чашки Петри подписываются и помещаются в термостат при температуре 28 °С в течение 1-2 дней.  По окончании времени инкубирования производится подсчет КОЕ, а затем пересчет грибных и бактериальных зачатков на 1 г сухой почвы.  

Состав микроорганизмов является одним из важнейших параметров, который позволяет не только уточнить типологию почвы, но и оценить перспективы ее использования в различных областях производства. В данном случае было проведено исследование с целью оценки воздействия экспериментального экранирующего материала на состояние естественной почвенной микробиоты. [2]

После проведения посевов из разведений почвенных суспензий на чашки Петри с твердыми питательными среда и периода их культивирования был произведен подсчет колониеобразующих единиц бактерий, актиномицетов и грибов. Результаты измерений по варианту опыта ПРП-1, где в опытном образце был заложен экранирующий материал из биодеградируемого полиэтилена низкого давления, занесены в таблицу 1.

Таблица 1 – Количественные состав микроорганизмов в ПРП-1

Группа м/о

Вариант опыта

Степень разведения

Среднее количество м/о, КОЕ/г

Отклонение от среднего

Квадрат отклонений

t-критерий при р≤0,05

Бактерии

К

V

3,65

0,05

0,0025

0

О

V

3,65

0,15

0,0225

Грибы

К

V

5,55

0,05

0,0025

1,3

О

V

5,75

0,15

0,0225

Актиномицеты

К

V

6,3

0,4

0,16

0,7

О

V

6

0,2

0,04

 

Наибольшие значения исследуемого показателя в ПРП-1 можно отметить в группе актиномицетов – 6-6,3 *105 КОЕ/г, наименьшее значения зафиксированы в группе почвенных бактерий и составляют 3,65 *105 КОЕ/г. При сравнении контрольных образцов, без добавления экранирующего материала в виде кусочков биоразлагаемого пластика, с опытными можно говорить о незначительности различий, т.к. при расчете t-критерия на 0,05 уровне значимости был получен результат 0 для бактерий, 1,3 для грибов и 0,7 для актиномицетов. Следовательно между данными выборками нет статистически значимых различий. Таким образом, наличие биоразлагаемого полиэтилена на почвенную микрофлору в течение срока проведения опыта не оказывает влияния.

Данные по второму варианту опыта – ПРП-2 – с использованием в качестве экранирующего материала дробленого полиэтилентерефталата приведены в таблице 2.

Таблица 2 – Количественные состав микроорганизмов в ПРП-2

Группа м/о

Вариант опыта

Степень разведения

Среднее количество м/о, КОЕ/г

Отклонение от среднего

Квадрат отклонений

t-критерий при р≤0,05

Бактерии

К

V

4,25

0,25

0,0625

2

О

V

3,55

0,25

0,0625

Грибы

К

VI

2,019

0,05

0,0025

0,2

О

VI

2,095

0,15

0,0225

Актиномицеты

К

V

4,6

0,2

0,04

0,2

О

V

4,55

0,15

0,0225

 

При анализе полученных данных по ПРП-2 можно выделить следующие особенности: максимальные значения КОЕ/г были получены по грибной микрофлоре и составляют 2,0-2,1 *106; минимальные значения зафиксированы по группе почвенных бактерий – 3,55-4,25 *105. При проведении статистического анализа по критерию Стьюдента результаты по группам грибы и актиномицеты не имеют статистически значимых различий. Значение по бактериальной микрофлоре находится на границе статистически значимых различий. Так, значение по опытному варианту меньше, чем в контрольном образце. Однако из-за того, что отрицательное воздействие по другим исследуемым группам микроорганизмов не подтверждается, возможно влияние других, не учитываемых в данном исследовании факторов.

Полученные данные по ПРП-3, где исследовалось влияние дробленого нейлона на количественный состав микроорганизмов, отражены в таблице 3.

 Таблица 3 – Количественные состав микроорганизмов в ПРП-3

Группа м/о

Вариант опыта

Степень разведения

Среднее количество м/о, КОЕ/г

Отклонение от среднего

Квадрат отклонений

t-критерий при р≤0,05

Бактерии

К

V

5,2

0,1

0,01

0,2

О

V

5,25

0,25

0,0625

Грибы

К

VI

1,95

0,25

0,0625

1,3

О

VI

1,63

0,05

0,0025

Актиномицеты

К

V

7,1

0,2

0,04

1,8

О

V

6,65

0,15

0,0225

 

Наименьшие показатели по количеству колониеобразующих единиц зафиксированы в группе бактерий, как и в предыдущих вариантах ПРП-1 и ПРП-2 и составляют 5,2-5,25 *105, а наибольшие – грибы – 1,63-1,95 *106. Однако, при анализе статистически значимых различий, были получены значения 0,2; 1,3 и 1,8, которые < 2. Таким образом, различия между опытными и контрольными вариантами не выявлены, следовательно наличие данного вида пластика в почве на протяжении всего времени опыта не существенно для микроорганизмов исследуемых групп.

Таким образом, в результате проведенного исследования по изучению воздействия на почвенную микрофлору разных видов пластика, можно сделать вывод, что в процессе всего времени экспозиции опыта не было оказано существенного влияния на почвенные микроорганизмы исследуемых групп.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Практикум по биологии почв: Учеб. пособие / Зенова Г.М., Степанов А.Л., Лихачева А.А., Манучарова Н.А. – М.: Издательство МГУ, – 120 с.
  2. Сидоренко О.Д. Микробиология: учебник. – М.: Инфра-М, 2005. – 285 с.

LITERATURE

  1. Praktikum po biologii pochv: Ucheb. posobie / Zenova G.M., Stepanov A.L., Lihacheva A.A., Manucharova N.A. – M.: Izdatel'stvo MGU. – 2002. – S. 120.
  2. Sidorenko O.D. Mikrobiologija: uchebnik. – M.: Infra-M. – 2005. – S. 285.